1. Принципы определения микроорганизмов в почве
a) Прямые методы учета - Среди методов количественного анализа наиболее объективным является метод прямого микроскопирования почвы, принцип которого был предложен С.Н. Виноградским. При этом способе готовят почвенную суспензию и в определенном объеме ее с помощью микроскопа подсчитывают общее число микроорганизмов. Последующим пересчетом можно установить, сколько микроорганизмов приходится на 1 г исследуемой почвы. С.Н. Виноградский готовил препараты на предметном стекле и просматривал их под оптическим микроскопом. В поле зрения можно было видеть палочковидные бактерии, мелкие и крупные кокки, иногда обрывки мицелия грибов и актиномицетов и другие микроорганизмы.
b) Метод посева: - Состав отдельных групп микроорганизмов (бактерии, актиномицеты, грибы и т. д.) может быть уточнен посевом почвенной суспензии на разные по составу твердые питательные среды, на которых затем развиваются зародыши тех или иных групп микроорганизмов. В практике обычно используют агаризованные или желатинизированные, а иногда силикогелевые питательные среды. После инкубации засеянных чашек в термостате подсчитывают выросшие на твердой питательной среде колонии. Допуская, что каждая колония произошла из одного зародыша того или иного микроорганизма, устанавливают число клеток во взятом образце почвы. Подобный пересчет имеет ряд условностей.
Метод Коха. 3-4 пробирки с МПЖ расплавляют в водяной бане при 40-45°С. Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленным МПЖ, равномерно размешивают его, вращая пробирку между ладонями, каплю разведенного материала из первой пробирки переносят во вторую, из второй в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки выливают в стерильные чашки Петри. МПЖ должен равномерно покрыть дно чашки. После того как желатин застынет, чашки ставят, чашки ставят крышкой вверх в термостат при температуре 20-22°С. Вместо МПЖ в настоящее время используют МПА. Каждая попавшая в желатин или агар микробная клетка размножается только в том месте, куда была внесена вначале, и образует видимое невооруженным глазом скопление микроорганизмов - колонию, которую отсеивают на МПБ или скошенный МПА для получения чистой культуры.
c) Методы выявления микробных пейзажей: - Метод обрастания стекол по Холодному. На ровной поверхности почвы делают ножом разрез, глубина которого зависит от исследуемого горизонта. Отмытые и обезжиренные стекла плотно прижимают к вертикальной стенке разреза и засыпают почвой. В пахотном слое стекла помещают на 3 - 5 см ниже поверхности. Сверху разрез засыпают почвой и место, где заложены стекла, отмечают этикеткой. Стекла выдерживают в почве в зависимости от задачи исследования от недели до нескольких месяцев. После истечения времени экспозиции убирают почву с тыльной стороны стекол, "откидывают" их от стенки и вынимают. Тыльную сторону вытирают сухой тряпкой, а опытную поверхность стекол высушивают на воздухе и фиксируют. После фиксации стекло погружают в воду опытной поверхностью вниз, не доводя его до дна. При этом крупные частицы почвы, отмокая, падают на дно, а фиксированные микроорганизмы и мелкие частицы остаются на стекле. После промывки препарат погружают в раствор карболового эритрозина на срок от 30 мин до 24 ч. Окрашенные препараты исследуют под микроскопом с иммерсионной системой. При микроскопировании отмечают характер микрофлоры, плотность обрастания стекол и доминирующие формы. Отдельные ассоциации микроорганизмов можно запечатлеть, используя микрофотосъемку.
d) Метод капилляров: - Новые возможности в области изучения микробных пейзажей почвы открывает капиллярный метод Б.В. Перфильева и Д.Р. Габе. Для изучения группового состава микроорганизмов почв ими сконструирован капиллярный прибор - педоскоп, который может быть использован и для работы с грунтами. Педоскоп представляет собой набор капиллярных ячеек с 5--6 прямоугольными каналами. Ячейки закладывают в пазы широкого стеклянного держателя и заполняют полужидкой агаризованной средой, содержащей в качестве органического субстрата гумусовые вещества (фульвокислоты). Это создает для микроорганизмов условия, близкие к почвенным. Педоскоп выдерживают в почве 1,5--2 месяца, затем просматривают его под микроскопом. С помощью этого метода удается выявить характерные для почвы микробные ассоциации.
1.1 Методы оценки суммарной активности почвы и активности отдельных микробиологических процессов в почве
a) Нитрифицирующая активность почвы, показателей такой активности служит нитрификационная способность почвы, характеризующая мобилизуемость азотного запаса почвы в результате деятельности микроорганизмов. Нитрификационную способность устанавливают по нарастанию в почве количества нитратов после выдерживания ее при определенных условиях в термостате. Описанная проба свидетельствует о потенциальной способности почвы накапливать то или иное количество минерального азота. Количество выделяемого диоксида углерода за определенный промежуток времени пересчитывают на 1 г абсолютно сухой почвы, или на 1 г гумуса.
b) Дыхание почвы - как показатель энергии разложения органических соединений почвы определяется по выделению углекислого газа;
c) Метод аппликаций - разложение ткани льняного полотна: чем выше в почве содержание подвижного азота и других элементов питания, тем активнее идет окисление клетчатки микроорганизмами. Клетчатка служит для них только источником углерода. Поэтому при отсутствии в почве азота целлюлоза разрушающие микроорганизмы не могут использовать клетчатку, так как кроме углерода им нужен и азот, а также и другие элементы питания, которые они берут извне. Следовательно, биологическая активность почвы, определенная по интенсивности разложения полотна, служит показателем интенсивности не только процессов не только превращения углерода, но и обеспеченности почвы азотом и другими элементами.
d) Метод ферментативных показателей: Для оценки биологической активности почвы исследуют также ферменты, находящиеся в почве. В основном их продуцируют микроорганизмы, поэтому между показателями активности ферментов почвы и определенными микробиологическими процессами намечается коррелятивная зависимость.
Абсолютные значения отдельных показателей активности ферментов различаются для почв разных климатических зон, что может быть использовано в диагностических целях.
При отмирании микроорганизмов окружающая среда еще более обогащается ферментами, которые в значительной части адсорбируются почвенными коллоидами, что способствует их стабилизации. Отмечено, что ферментные процессы в почве прекращаются при значительно более низкой влажности, чем деятельность микроорганизмов. Определение активности ферментов почвы может дать представление об их плодородии.
1.2 Влияние минеральных и органических удобрений на активацию микробиологических процессов
Органические удобрения - навоз, городские отходы, компосты и др. способствует интенсификации микробиологических процессов, поскольку они являются источником энергии и элементов питания микроорганизмов.
Содержание органического вещества в навозе составляет 20-25%; количество питательных для растений веществ ограничивается долями процента 0,5% азота, 0,2% P2O5; 0,6% K2O.
В навозе довольно много бактерий рода Pseudomonas, представителей группы кишечной палочки и других неспорообразующих палочковидных аммонификаторов. Некоторые из них могут вызывать денитрификацию. Многие аммонифицирующие бактерии навоза могут вызывать распад мочевины. Многочислена в навозе группа аэробных микроорганизмов, разлагающие целлюлозу, таких как Cytophaga, несколько беднее представлен род Cellvibrio и др. Обнаружены также анаэробные разрушители целлюлозы Clostridium omelianskii.
Внесение в почву удобрений не только улучшает питание растений, но и изменяет условия существования почвенных микроорганизмов, также нуждающихся в минеральных элементах.
При благоприятных климатических условиях количество микроорганизмов и их активность после внесения в почву удобрений значительно возрастают. Усиливая распад гумуса, увеличивается мобилизация азота, фосфора, и других элементов.
Внесение в почву минеральных и органических удобрений усиливает интенсивность микробиологических процессов, в результате чего сопряженно увеличивается трансформация минеральных и органических в-в. Характерным показателем активации микробной деятельности под влиянием удобрений служит усиление "дыхания" почвы, т.е. выделение ею CO2. Это результат ускоренного разложения органических соединений почвы, в том числе гумуса.
Внесение минеральных удобрений вызывало некоторое снижение численности актиномицетов и увеличение грибного населения. Это могло быть следствием сдвига рН в кислую сторону в результате внесения физиологически кислых солей: актиномицеты плохо переносят подкисление, а размножение многих грибов ускоряется в более кислой среде.
Как видно, минеральные удобрения, хотя и активизировали деятельность микроорганизмов, но уменьшили потери гумуса. Навоз оказал на все группы микроорганизмов почвы весьма благоприятное действие.
2. Характеристика объектов и методов исследований
2.1 Характеристика почвы чернозем компостированный, чернозем N120 P90, чернозем влажный и микроорганизмов
Черноземные почвы - это такая растительно-наземная почва, толщина которой в среднем около 60 см. Её плодородие определяется наличием гумуса, который представляет собой перегной, образовавшийся в результате обмена питательными веществами между микроорганизмами и растениями. Гумус состоит из гуминовых кислот и фульвокислот, которые необходимы для полноценного роста растений и укрепления их корневой системы. Чернозем характеризуется самым высоким содержанием питательных элементов среди почв и грунтов, суглинистым механическим составом, зернистой структурой с отдельными агрегатами и нейтральной реакцией среды.
Черноземные почвы отличаются значительным содержанием органических веществ, обусловливающих темный цвет их; такого содержания органических веществ мы не находим в других почвах в недалеком расстоянии от чернозема, при условиях, по-видимому, вполне сходных.
Главная масса микроорганизмов сосредоточенна в пределах верхней 20 -сантиметровой толщи почвы. Микроорганизмы принимают самое активное участие в процессе гумусообразования (биохимический процесс). В то же время определенное количество микроорганизмов является активными деструкторами гумуса.
Необходимо отметить большое влияние микроорганизмов на содержание почвенного воздуха. Колебание кислорода и углекислого газа, почти полностью регулируется микроорганизмами. Исключительно велика роль микроорганизмов в циклах превращения азотосодержащих соединений и фиксации его из атмосферы.
Черноземные почвы являются весьма благоприятной средой для развития таких микроорганизмов: Bacillus cereus, Bacillus idosus, Bacillus megaterium, род Pseudomonas - до 15%, род Azotobacter - до 15%.
2.2 Взятие средней почвенной пробы
Образцы почвы для исследований берутся с соблюдением ряда требований:
а) Образец, должен быть "средней почвенной пробой", которую получают путем смешивания отдельных образцов почвы (со 100 м 2 берут пробу из трех точек, с площади свыше 100 м 2 - из пяти, с 1 га и более из 15 точек);
б) Образец должен отражать характеристику исследуемой почвы: если анализируют пахотную почву, то пробы следует брать из всего пахотного слоя снимая верхние 2 см; если анализируют определенный генетический горизонт или почву по профилю, пробу берут из соответствующего горизонта;
в) Образец берется с соблюдением правил асептики, стерильным буром, стерильной лопатой или ножом в стеклянную широкогорлую стерильную банку, закрывают корковой пробкой, обернутой стерильной ватой, или в стерильные полиэтиленовые мешки. Бур, лопату и нож в поле тщательно очищают, смачивают спиртом и обжигают;
г) Образец почвы должен иметь четкую характеристику, откуда он взят. Для этого на пакеты или банки наклеивают этикетку с указанием места взятия пробы, горизонта и других необходимых сведений;
д) Образец почвы для микробиологического анализа должен быть свежим. Обычно образцы почвы анализируют в первые сутки после взятия пробы. Допускается хранение в холодильнике в течение двух суток;
е) Образцы почвы должны быть однородными. Для этой цели средний образец тщательно перемешивают, соблюдая правила асептики, вынимают корни растений и различные включения, например, камни.
2.3 Определение влажности
Для определения влажности почвы берется 10-20 г почвы. Сначала взвешивается пустой бюкс, затем бюкс с почвой. Данные записываются. Образец высушивается при 105о. С в сушильном шкафу и после достижения постоянной массы определяют содержание сухой почвы в 1 г сырой.
Влажность (А) почвы определяют по формуле:
Где в - масса бюкса с сырой почвой;
с - масса бюкса с сухой почвой;
а - масса пустого бюкса.
2.4 Учет численности микроорганизмов в почве
Учет численности микроорганизмов в почве проводится различными методами, наиболее распространенным является метод питательных пластин (метод Коха). Этот метод позволяет учесть количество живых клеток в почве и выявить родовой, а иногда и видовой состав, выделить чистые культуры бактерий. Для различных физиологических групп микроорганизмов существуют различные среды, так как потребность в питательных веществах у них различная. Используются плотные и жидкие среды.
2.5 Приготовление почвенной суспензии и посев на питательные среды
На стерильное часовое стекло, предварительно взвешенное, стерильным шпателем или алюминиевой ложкой помещают 1 г почвы и накрывают другим часовым стеклом для предупреждения попадания микроорганизмов из воздуха. Стекла, шпатели и ложки стерилизуют фламбированием. почва микробиологический удобрение
Навеску почвы переносят в колбу, емкостью 250 мл содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды, интенсивно взбалтывают вращательным движением (не смачивая пробки) в течение 5 минут и дают отстояться грубым частицам почвы.
Одновременно со взятием навески для анализа из средней пробы отбирают 10-20 г почвы для определения влажности.
Затем из почвенной суспензии готовят разведения, содержащие разные концентрации почвы. 1 мл суспензии в первой колбе соответствует разведению 10-2. Последующие разведения (10-3, 10-4, 10-5, 10-6 и т.д.) готовят в пробирках с 9 мл стерильной воды. В этом случае из предыдущего разведения стерильной пипеткой переносят 1 мл суспензии в последующую пробирку. Пипетки каждый раз ополаскивают.
Из полученных разведений проводят посев на плотные и жидкие среды. Посев суспензий на плотные питательные среды проводят, как правило, поверхностно. Для этого агаризованные питательные среды разливают в стерильные чашки Петри и после охлаждения на поверхность среды стерильной градуированной пипеткой (на 1 мл) наносят 0,05 мл почвенной суспензии из соответствующего разведения, затем стерильным шпателем Дригальского растирают калю досуха. При растирании открытую чашку держат почти в вертикальном положении около пламени горелки. Шпатель стерилизуют фламбированием. Посев и каждого разведения проводят минимум на 2-3 параллельные чашки.
При глубинном посеве берут 1 мл почвенной суспензии и вносят в стерильную чашку Петри, заливают охлажденным до 45о С расплавленным агаром и перемешивают кругообразными движениями. При глубинном посеве выявляется меньше микроорганизмов, чем при поверхностном.
Все засеянные чашки Петри и пробирки ставят в термостат с температурой 28-30о С на определенный срок инкубации, затем вынимают и учитывают результаты.
2.6 Среды, применяемые для различных физиологических групп микроорганизмов
На мясо-пептонном агаре (МПА) учитывают сапрофитные микроорганизмы, использующие органические формы азота. На крахмало-аммиачном агаре (КАА) выявляют численность микроорганизмов, способных использовать минеральные формы азота (особенно актиномицеты).
Жидкие среды Имшенецкого и Солонцевой используют для учета аэробных целлюлозо разрушающих микроорганизмов, среду Гильтая - для нитрифицирующих бактерий, среду Виноградского - для анаэробных азотфиксаторов (Cl. Pasteurianum).
Для учета азотобактера используют метод обрастания комочков почвы (на агаризованной среде Виноградского или Эшби).
2.7 Учет численности микроорганизмов методом обрастания комочков почвы
Содержание колоний азотобактера определяют на агаризованной среде Эшби. На твердой поверхности среды раскладывают по трафарету 40-50 комочков почвы диаметром 1-2 мм, чашки помещают во влажную камеру и ставят в термостат. На третьи-пятые сутки инкубации развиваются колонии азотобактера, слизистые, бело-серые, которые постепенно приобретают темно-бурый (Azotobacter chroococcum) или зеленый пигмент (Az. Agilis).
Подсчитывают комочки почвы, обросшие микроорганизмами, а затем определяют, какой процент они составляют от общего числа комочков почвы (относительная оценка плотности заселения микроорганизмов учитываемых групп в почве).
После определения процента обрастания комочков почвы азотобактером и определения степени разложения льняного полотна (биологическая активность) результаты общего микробиологического анализа почвенного образца можно представить в виде таблицы.
Общее количество микроорганизмов на МПА | Количество споровых на МПА | Количество неспоровых на МПА | Плотность азотобактера, % | Биологическая активность (% разложения полотна) | |
2.8 Определение биологической активности почвы по интенсивности разложения полотна
Чем выше в почве содержание подвижного азота и других элементов питания, тем активнее идет окисление клетчатки микроорганизмами. Клетчатка служит для них только источником углерода. Поэтому при отсутствии в почве азота целлюлозоразрушающие микроорганизмы не смогут использовать клетчатку, так как кроме углерода им нужен и азот, а так же и другие элементы питания, которые они берут извне.
Следовательно, биологическая активность почвы, определенная по интенсивности разложения полотна, служит показателем интенсивности не только процессов превращения углерода, но и обеспеченности почвы азотом и другими элементами.
Целлюлозоразрушающие микроорганизмы, разлагая клетчатку, синтезируют и частично выделяют в среду аминокислоты. Поэтому при обработке полуразрушенного полотна 0,5%-ным раствором нингидрина в тех местах, где активно развивались микроорганизмы и разлагалась клетчатка, на полотне образуются сиреневые пятна (реакция аминокислот с нингидрином).
Для опыта хорошо отмытые стекла (10*50) обшивают льняным полотном. Стерильной лопаткой и стерильным ножом делают почвенный разрез на глубину 35 см. К ровной стенке разреза по профилю прикладывают стекло с полотном, с противоположной стороны стекло засыпают почвой и прижимают плотно к стенке. Полотно закладывают ниже поверхности почвы на 2-3 см. В том месте, где помещают полотно, ставят этикетки.
Через 20-30 дней стекла откапывают, подсушивают полотно, осторожно стряхивая с него почвенные частицы, и обрабатывают 0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне для выявления аминокислот.
Для определения степени разложения полотна в процентах вырезают определенную его площадь на глубину горизонта (анализ проводят по горизонтам), промывают остаток полотна водой, высушивают и взвешивают. Потом кусок такой же площадью вырезают из контрольного полотна и тоже взвешивают.
3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1 Учет численности микроорганизмов на плотных средах
После инкубации чашки с засеянными средами вынимают из термостата и подсчитывают число выросших колоний, которые отражают число живых клеток микроорганизмов в почве.
При подсчете колоний на плотных питательных средах (МПА) чашки Петри, не открывая, просматривают в проходящем свете и с внешней стороны донышка чашки отмечают колонии тушью или чернилами. Чтобы учесть и мелкие колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой. Если на чашке больше 200 колоний, то их можно подсчитать с помощью камеры Вольфюгеля.
Чтобы установить количество клеток бактерий в 1г сырой почвы, число клеток в 1 мл умножают на степень разведения, т.е. число, показывающее, во сколько раз в каждом конкретном случае разбавили 1 г почвы. Например, при разведении 10-3 умножают на 1000, 10-4 на 10000,… 10-6 на 106 и т.д.
При глубинном посеве для подсчета количества микроорганизмов в 1 г сырой почвы число клеток (колоний) умножают на степень разведения.
При поверхностном посеве вначале определяют количество клеток микроорганизмов в 1 мл соответствующего разведения, для чего число колоний умножают на 20 (так как было посеяно 0,05 мл).
Для сравнения количества бактерий в разных почвах необходимо подсчитать их число в 1 г абсолютно-сухой почвы. Для этого количество клеток в 1 г сырой почвы делят на количество абсолютно-сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.
Чернозем компостированный: (среднее число колоний 39)
Чернозем N120 P90: (среднее число колоний 18)
Чернозем: (среднее число колоний 54)
3.2 Определение влажности почвы
Чернозем компостированный:
Абсолютно сухой почвы в 1 г сырой: 1-0,59 = 0,41 г
Чернозем N120 P90
Абсолютно сухой почвы в 1 г сырой: 1-0,23 = 0,77 г
Чернозем
Абсолютно сухой почвы в 1 г сырой: 1-0,363 = 0,637 г
3.2 Определение биологической активности по разложению льняного полотна
Для опыта хорошо отмытые стекла (10*50) обшивают льняным полотном. Стерильной лопаткой и стерильным ножом делают почвенный разрез на глубину 35 см. К ровной стенке разреза по профилю прикладывают стекло с полотном, с противоположной стороны стекло засыпают почвой и прижимают плотно к стенке. Полотно закладывают ниже поверхности почвы на 2-3 см. В том месте, где помещают полотно, ставят этикетки.
Через 20-30 дней стекла откапывают, подсушивают полотно, осторожно стряхивая с него почвенные частицы, и обрабатывают 0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне для выявления аминокислот.
Для определения степени разложения полотна в процентах вырезают определенную его площадь на глубину горизонта (анализ проводят по горизонтам), промывают остаток полотна водой, высушивают и взвешивают. Потом кусок такой же площадью вырезают из контрольного полотна и тоже взвешивают.
